背景技术：

2.在真核细胞中，与以分泌途径为主的的n-连接糖基化修饰不同，o-乙酰氨基葡萄糖修饰(o-glcnac修饰)是广泛发生在核质蛋白上面的一种翻译后修饰，单糖glcnac直接通过羟基连接在丝氨酸/苏氨酸上。o-glcnac修饰是营养物质通过己糖胺生物合成途径的产物，葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和核苷酸代谢途径负责产生o-glcnac修饰的的底物udp-glcnac。细胞内两种酶负责o-glcnac修饰的稳态，o-glcnac糖基转移酶即ogt负责o-glcnac修饰的添加，o-glcnac糖苷水解酶即oga负责o-glcnac修饰的水解。除了依赖于营养物质，o-glcnac修饰信号对细胞内的各种细胞应激例如热休克、缺氧和营养缺乏都高度敏感。因此o-glcnac修饰被认为是一种营养和应激传感器，调控着转录、翻译、信号传导和代谢的细胞过程。生理上，o-glcnac稳态的破坏与许多人类疾病的发病机制有关，包括癌症、糖尿病和神经退行性疾病。3.乳腺癌雌激素受体依赖的调控蛋白1(greb1)最早发现于mcf-7乳腺癌细胞，是被雌激素诱导产生的调控蛋白。greb1通常表达在雌激素受体α(erα)阳性的乳腺癌细胞中，而不表达erα阴性的细胞之中。在乳腺癌细胞中，greb1是雌激素受体调控的基因，抑制greb1的表达就等同于抑制了乳腺癌细胞的增殖。除了在乳腺癌细胞中表达，greb1在卵巢癌、肝癌和前列腺癌细胞中也有表达。在激素不敏感的肿瘤例如肝癌中，greb1的表达对肝癌细胞的增殖十分重要，主要是通过抑制tgfβ信号通路来促进细胞的增殖。4.在最新的研究表明greb1具有类似于ogt的活性，greb1能够在体外给它的靶蛋白erα进行o-glcnac修饰。greb1含有1949个氨基酸，分子量约216kda。通过计算生物学分析：greb1有3个结构域，n端的zn结合结构域、随后的解旋酶结构域和c端的糖基转移酶(gt)结构域。通过突变gt结构域的底物结合位点的氨基酸发现，突变的greb1失去了o-glcnac糖基转移酶活性。这说明gt结构域既含有催化活性位点，又含有底物结合位点。同时有文献报道，greb1经过截短保留gt结构域，仍然可以与目的蛋白相互作用，这些说明gt很有可能是发挥o-glcnac修饰的主要功能结构域。对于这种全新的催化o-glcnac修饰合成的糖基转移酶，目前对于它的底物仍然知之甚少，因此在体外如果能纯化大量的有活性的greb1，对于研究非ogt底物的o-glcnac修饰研究有重大推动意义。由于全长的分子量较大，为了得到大量的糖基转移酶活性结构区域，很有必要对greb1进行截短体改造，从而确定其催化o-glcnac修饰的关键区域。

技术实现要素：

5.为了研究体非常规的o-glcnac修饰(不同于ogt催化)，提高乳腺癌雌激素受体依赖的调控蛋白1(greb1)的表达水平，本发明通过改造greb1，只保留greb1的糖基转移酶结构域，即gt结构域，获得成功表达的gt改造蛋白，并用于体外o-glcnac修饰的合成。6.本发明的第一方面，提供一种改造的greb1，所述改造的greb1是将greb1去掉n端的结构域，只保留gt结构域，gt结构域其氨基酸序列如seq id no：1所示。7.进一步地，所述的gt结构域的核苷酸序列经过大肠杆菌密码子优化，如seq id no：2所示。8.本发明的第二方面，提供一种改造的greb1基因的制备方法，包括如下步骤：9.(1)将greb1基因序列进行截短，保留gt结构域，gt基因序列经过大肠杆菌偏好密码子优化，核苷酸序列如seq idno：2所示。10.(2)构建改造的gt结构域重组质粒：将gt基因插入到载体pgex-6p-1的bamhⅰ和salⅰ限制酶切位点上。11.(3)构建含有gt突变体基因的重组表达菌株：将重组质粒转化到克隆菌dh5α中，挑取单克隆菌，菌液pcr初步验证，然后测序，最后转化到表达菌bl21(de3)中获得bl21-gt-6p-1基因。12.(4)gt蛋白的的制备：将表达菌在10ml lb培养基中过夜扩大培养，然后以1:100的比例转入到1l的培养基中培养，待表达菌生长至对数期，即od值达到0.4-0.6后，加入1mm iptg诱导，诱导温度为16℃，诱导时间为12h。菌液4000rpm离心20min，去上清，用60ml 0.01m pbs将沉淀重悬混匀，超声破碎。破碎完毕后12000rpm离心20min收集上清蛋白样，通过0.45μm滤膜除去不溶物。然后开始上样于预先已经用pbs平衡好的gst亲和层析柱，最后用洗脱缓冲液(50mmol/ltris-hcl ph8.0，内含10mmol/l gsh)进行洗脱，收集洗脱峰，用ddh2o超滤，最后冻存，得到gt蛋白。13.本发明的第三方面，提供gt蛋白在催化非经典的o-glcnac修饰的用途。14.本发明的有益效果在于：15.本发明提供的gt蛋白在体外催化活性实验表明，gt能够在体外对靶蛋白和复杂蛋白样品催化o-glcnac修饰的合成，因此gt蛋白在研究非经典的(不同于ogt的催化途径)o-glcnac修饰方面具有很大的应用潜力。附图说明16.图1为greb1的截短策略；17.图2为gt基因pcr分析(a)和pgex6p-1酶切结果(b)；18.图3为gt蛋白纯化后的sds-page分析(a)和western blotting结果(b)；19.图4为简单蛋白作为底物活性验证的western blotting结果；20.图5为复杂样品为底物活性验证的western blotting结果，红框代表修饰增加的带。具体实施方式21.通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。22.本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟知。本发明中未详细阐述的内容请参见《分子克隆实验指南》，j.萨姆布鲁克，d.w.拉塞尔等主编。23.【实施例1】greb1截短体的设计24.greb1的c端gt结构域和噬菌体等低等生物负责给dna进行糖基化修饰的糖基转移酶结构域高度保守，这提示gt结构域可能是之前未报道的糖基化合成机器(类似于ogt的活性)。由于野生型的greb1分子量太大，为了在体外纯化得到大量的greb1，通过截短greb1，只保留gt结构域，改造策略如图1所示，所改造的优化的gt基因序列由北京擎科生物科技有限公司负责合成。25.【实施例2】gt结构域的克隆与表达26.将gt结构域基因通过bamhⅰ和salⅰ限制性核酸内切酶切位点插入到pgex-6p-1上，gt基因pcr分析和pgex6p-1酶切结果如图2所示。将重组质粒转化到克隆菌dh5α中，挑取单克隆菌，菌液pcr初步验证，然后送阳性克隆测序，最后重组质粒转化到表达菌bl21(de3)中，先进行少量诱导表达确定其是否表达，确定诱导表达的条件，诱导条件如下：诱导温度16℃，诱导时间为12h。随后在1.5l的lb培养基中大量培养gt表达菌，扩大培养2.5h使表达菌生长至对数期，即od达到0.4-0.6，然后加入iptg使终浓度为1mm，16℃，1600rpm诱导12h。27.【实施例3】gt蛋白的分离纯化28.将1.5l菌液4000rpm离心20min，去上清，用60ml 0.01mpbs将沉淀重悬混匀。超声破碎，功率为200w，破碎10s，停10s，共90次。破碎完毕后12000rpm离心10min收集上清蛋白样，使用0.45μm滤膜滤去不溶物。然后上样于预先用pbs平衡好的gst亲和层析柱，流速设置为1ml/min，上完样后，用pbs缓冲液洗涤柱子，洗去非特异性结合的杂蛋白，直到蛋白检测仪所测值不再变化，大约需要1h，最后用洗脱缓冲液(50mmol/ltris-hcl ph8.0，内含10mmol/l gsh)进行洗脱，收集洗脱峰，用ddh2o超滤，最后冻存。结果显示，在体外成功表达gt蛋白，如图3所示。层析柱用ddh2o洗涤后用20％乙醇洗涤后保存。29.【实施例4】gt结构域的活性验证30.(1)以标准蛋白为底物的糖基转移酶活性验证31.收集mcf-7(乳腺癌细胞系)细胞裂解液样品，进行bca定量测蛋白，分为3管，每管3mg。随后准备o-glcnac糖基化修饰体系，如下表所示：[0032][0033][0034]其中，第一组为对照组，第二组和第三组为实验组。[0035]反应缓冲液配方如下：[0036][0037]整个反应体系在37℃水浴锅中进行，反应时间为5h。反应完后，蛋白样品进行免疫沉淀富集，免疫沉淀步骤如下：[0038]1)3μg的erα抗体与反应完的混合液进行4℃孵育过夜。[0039]2)然后加入protein a/g磁珠4℃继续孵育10h。[0040]3)随后用ripa缓冲液洗涤5次，最后磁珠加入100μl loading buffer制样。[0041]富集样品进行免疫印迹检测：取20μl样品进行sds-page分析，电泳结束后转膜至pvdf膜上。后续经过5％bsa封闭、tbst洗涤、孵育ctd110.6抗体(识别o-glcnac修饰)、tbst洗涤、孵育二抗、tbst洗涤，最后经过显影液反应，暗室显影。结果如图4所示，在添加了gt蛋白后，erα的o-glcnac修饰明显升高，这说明gt蛋白改造成功，具有体外催化o-glcnac修饰的活性。[0042](2)以复杂样品为底物的糖基转移酶活性验证[0043]收集mcf细胞裂解液，bca定量后，分成3组，每组取20μg作为复杂样品底物。然后分别添加gt蛋白0、1和5μg，补充udp-glcnac，在和(1)里面的一样的缓冲体系中反应，37℃水浴锅中催化5h，最后加入loading buffer制备样品，进行免疫印迹分析即western blotting分析，孵育的一抗为ctd110.6(o-glcnac修饰抗体)结果显示在添加gt蛋白的细胞裂解液中有多条带出现了o-glcnac修饰的升高，这说明细胞里面还有其他的靶蛋白可以被这种特殊的糖基转移酶催化。[0044]本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。